植物の環境感覚:刺激受容から細胞応答まで - 文部科学省 科学研究費補助金 新学術領域研究 平成22年度~26年度

A03 公募研究:『植物細胞場』解析技術開発

液胞を標的とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発

研究代表者 岩田 達也 名古屋工業大学大学院工学研究科・助教 研究代表者ホームページ
連携研究者 神取 秀樹 名古屋工業大学大学院工学研究科・教授

研究概要

 本研究の目的は、植物細胞の液胞や葉緑体内膜部への利用を念頭に、酸性条件において機能する酸化還元状態応答性蛍光タンパク質を開発することである。また、そのためのスクリーニング系を構築することである。
 液胞は花の色に関与するアントシアニン類が輸送されるオルガネラである。アントシアニンは抗酸化剤としての役割があり、このとから液胞は酸化還元状態と密接に関与していると考えられる。同様に、老廃物の分解、蓄積、浸透圧の調節などの機能も担っており、これらは細胞の生長、分化に伴って適切に機能調節を行っている。一方、葉緑体は光合成によってエネルギーと還元力の産生をおこなっており、光合成活性に依存して酸化還元状態を変化させていると考えられる。
 私はこれまでに外界の酸化還元状態に応答して光誘起的に蛍光強度が減少する蛍光タンパク質(LOV変異体)の作出を行ってきた。ところが、LOVドメインは酸性条件(pH≤5)においてフラビンがアポタンパク質から解離する。上記のスクリーニングにおいてpHに対する影響は考慮されず、野生型LOVと同様に低pHではフラビンが解離し機能させられない可能性がある。そこで、酸性条件で蛍光を発する蛍光タンパク質の大腸菌でのスクリーニング系の開発を行う。具体的には、大腸菌内膜に光誘起プロトンポンプを発現させ、ペリプラズム領域にランダム変異を導入した蛍光タンパク質を発現させる。光照射に伴うプロトンポンプの活性化によりペリプラズム領域を酸性化させ、蛍光強度が減少しないタンパク質をスクリーニングする。フラビンタンパク質遺伝子に対するによって酸性条件で蛍光を発する変異体をスクリーニングする。

図:概略図

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